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宾大开发新型基因编辑工具,可在原代细胞中实现近100%的编辑效率

迄今,由 RNA 引导的 CRISPR-Cas 系统已经有十多年的发展历史。期间,有许多新的技术被开发出来,并被用于生物学和医学等领域的研究中,比如,了解疾病的遗传基础、通过编程逆转疾病状态的工程细胞治疗等。


(相关资料图)

在此基础上,为了进一步落实基因组编辑技术在基础研究、细胞工程和基因治疗等领域的应用,相关领域的研究人员正在紧锣密鼓地开发更好的方法,希望能将 CRISPR-Cas 系统更有效地递送至原代细胞。

虽然已经有许多种(病毒载体、电穿孔和小分子药物等)CRISPR-Cas 系统的递送方法,但这些方法各自都存在着局限性。

具体来说,如果采用病毒式方法,病毒会不可避免地被整合到人的基因组,且会永远和人类的细胞一同存在,这会导致诸多安全问题。比如,若病毒载入的位点影响人类的抑癌基因,可能导致细胞发展为癌细胞;若病毒插入的位点不适合基因的表达,会造成低效率的基因编辑。并且,这种方法对载体的大小也有限制,无法包裹那些较大的载体。

如果采用电穿孔法,即先通过高电压击穿细胞膜,再将 CRISPR 的载体导入细胞中,会给细胞的活力和激活状态造成损伤。如果采用小分子化学药物包裹 mRNA 的方法,将载体递送到细胞中,会造成较高的生产成本,以及在细胞水平的表达量不统一,且 mRNA 也非常不稳定。

“要是我们能开发出一种方法,可以不用病毒、电击、mRNA,而是只用蛋白来实现基因编辑,就极大可能弥补当前那些传统方法存在的缺陷。”美国宾夕法尼亚大学史俊炜副教授表示。

图丨史俊炜(来源:史俊炜)

基于上述设想,他和团队设计了一套多肽辅助的纯蛋白基因组编辑(Peptide-Assisted Genome Editing,PAGE)的 CRISPR-Cas 系统(以下简称为 CRISPR-PAGE 系统),在方便、高效、无毒性的条件下,实现了对原代细胞的基因组编辑。研究结果显示,该系统在小鼠和人类原代 T 细胞中,能够实现高达 98% 的编辑效率;在人类原代造血干细胞和祖细胞中,则能够实现接近 100% 的基因编辑效率。

图丨CRISPR-PAGE 系统的开发(来源:Nature Biotechnology)

值得一提的是,CRISPR-PAGE 系统由穿透细胞的 Cas 蛋白和穿透细胞的核内体逃逸肽组成,只需 30 分钟的孵育期,就能在将细胞毒性和基因转录干扰降至最低的同时,实现强大的单基因组和多基因组编辑。

那么,具体来说,单基因组和多基因组编辑究竟是如何实现的呢?

“由于细胞膜和核膜都由脂类组成且带负电,因此我们就想,如果能在 CRISPR 蛋白的表面修饰足够多的正电或亲脂疏水性基团,这个 CRISPR 蛋白就会直接融合且穿透细胞膜和核膜,进而实现基因编辑。并且,在该方法中,蛋白和细胞之间是共孵育的,所以要实现单基因或多基因,只用孵育不同的蛋白即可。”史俊炜解释道。

同时,他也强调,该方法最大的应用意义在于,CRISPR-PAGE 系统是基于细菌生产,生产成本低、状态稳定、易于运输,同时也容易实现基因编辑,且编辑完后不留任何痕迹,也就是原代细胞里剩下的 CRISPR 的所有系统,会在两天之内完全清除。

2023 年 4 月 24 日,相关论文以《利用肽辅助基因组编辑的人类和小鼠原代细胞高效工程》(Efficient engineering of human and mouse primary cells using peptide-assisted genome editing)为题在 Nature Biotechnology 上发表[1]。

图丨相关论文(来源:Nature Biotechnology)

宾夕法尼亚大学博士后研究员张珍为该论文的第一作者,宾夕法尼亚大学免疫学研究所所长 E·约翰·惠里(E. John Wherry)、宾夕法尼亚大学表观遗传学所长雪莱·L·伯杰(Shelley L. Berger)教授和史俊炜副教授担任论文的共同通讯作者。

在这项研究中,该团队主要把 CRISPR-PAGE 系统用于人类的 T 细胞和血液干细胞中。事实上,包括巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞等在内的许多来自血液的细胞,都可以通过该系统实现基因编辑。

并且,如上所述,该方法是让带正电或带亲脂疏水基团的 CRISPR,通过带负电的细胞膜和核膜,遵循了基因正负电相互作用和脂类融合的原则,因此能为原代细胞的下一代基因工程,提供广泛通用的平台。

此外,该方法虽然已经实现了单基因或多基因敲除,但未来的基因编辑或细胞治疗方法,还要求能够达到单点突变、多点突变或整个基因的更换。因此,该团队后续也计划对该方法进行进一步的升级。

“虽然我们研究的这个方法是基于 CRISPR 的基因改造,但只要能够找到合适的表面带正电或具有亲脂疏水性的结构,其还能用于其他大分子或基于蛋白质的治疗递送,并有助于更多潜在治疗方法的开发。”史俊炜表示。

参考资料:

1. Zhang, Z., Baxter, A.E., Ren, D. et al. Efficient engineering of human and mouse primary cells using peptide-assisted genome editing. Nature Biotechnology (2023). https://doi.org/10.1038/s41587-023-01756-1

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